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Na+K+- ATP酶活性測定說明書(分光光度法)
點擊次數(shù):1839 更新時間:2019-04-18

Na+K+- ATP酶活性測定說明書(分光光度法)

貨號:YJ2218

規(guī)格:100管/48樣

產(chǎn)品簡介:

Na+K+- ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機磷。

Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷,通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性。

自備的儀器和用品

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板跑、研缽、冰和蒸餾水。

產(chǎn)品內(nèi)容:

提取液:液體100mL×1 瓶,4保存。

試劑一:液體 10mL×1 瓶,4保存。

試劑二:粉劑×1,-20保存;臨用前加入6ml蒸餾水充分混勻待用;用不完的4保存一周

試劑三:液體 2ml×1 瓶,4保存。

試劑四:粉劑×1瓶,4保存。用時加入3mL蒸餾水4保存

試劑五:粉劑×1 瓶,4保存。用時加入25ml蒸餾水,溶解后4保存一周

試劑六:粉劑×1 瓶,4保存。用時加入25ml蒸餾水,溶解后4保存一周

試劑七液體25ml×1,室溫保存。

試劑10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶,4保存。

0.5μmol/mL 標準磷應用液配制:試劑八 20倍稀釋,即取 0.1mL試劑1.9mL蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制:按H2O:試劑:試劑:試劑=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意:配試用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

樣品酶液的制備:

  1. 細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每500萬細菌或細胞加入1mL提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

  1. 血清(漿)樣品:直接檢測。

操作步驟

  1. 分光光度計預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至660nm,蒸餾水調(diào)零。
  2. 酶促反應(在EP管中加入下列試劑)

 

對照管

測定管

試劑一(μL

65

45

試劑二(μL

60

60

試劑三(μL

40

20

樣本μL

40

100

混勻,37(哺乳動物)或25(其他物種)準確水浴10min

試劑μL

25

25

μL

100

 

混勻,8000g,常溫離心10min,取上清液

  1. 定磷(EP或96孔板中依次加入下列試劑)

 

空白管

標準管

A

B

0.5μmol/ml標準磷應用液(μL

 

20

 

 

上清液(μL

 

 

20

20

蒸餾水(μL

20

 

 

 

定磷試劑(μL

200

200

200

200

混勻,室溫放置30min,在 660nm,記錄各管吸光值。

注意:

  1. 由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒100管保證測48Na+K+-ATP酶。
  2. 此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。
  3. 空白管和標準管只要做一管。

計算

  1. 血清(漿)Na+K+- ATPase活力的計算:

定義:規(guī)定每小時每毫升血清(漿)中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/mL= C標準管×V總)×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷V÷T

=7.5×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)

  1. 組織、細菌或細胞中Na+K+- ATPase活力的計算:
  1. 按蛋白濃度計算:

定義:規(guī)定每小時每毫克組織蛋白中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/mg)= C標準管×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V÷Cpr×V樣)÷T =7.5×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷Cpr

  1. 按樣本鮮重計算:

定義:規(guī)定每小時每克組織中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/g)= C標準管×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V÷(V÷V樣總×W)÷T=7.5×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷W

  1. 按細菌或細胞密度計算:

定義:規(guī)定每小時每1萬個細菌或細胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

Na+K+-ATP酶活力(U/104)= C標準管×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)×V÷(V÷V樣總×500)÷T=0.015×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)

C標準管:標準管濃度,0.5μmol/mLV總:酶促反應總體積,0.25mLV樣:加入樣本體積,0.1mL V樣總:加入提取液體積,1mLT:反應時間,1/6小時;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

 

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